4 mai 2016

Biophysique des compartiments intracellulaires à l’échelle du nanomètre

En collaboration avec G. Dietler et S. Kasas, Inst. de la Matière Complexe, et P De Los Rios Inst. de Physique Théorique, Ecole Polytechnique Fédérale de Lausanne

 

Nous avons initié un programme de Recherche sur l’utilisation de la microscopie à force atomique (AFM) pour l’étude de l’élasticité des membranes sur les cellules vivantes. L’hypothèse est que la membrane plasmique est hétérogène et qu’à ce titre des domaines possèdent des propriétés biophysiques différentes. Parmi ces dernières, les propriétés mécaniques ont été peu étudiées en raison de la difficulté technologique à réaliser ce genre d’investigation. L’AFM est la technique qui possède la meilleure résolution pour aborder ce problème. Cependant, il a fallu vaincre de nombreux défis méthodologiques. Ceci a nécessité le développement de nouvelles méthodologies avec notamment la réalisation de logiciels spécialisés (brevet PCT/US07/64727). Nous développons ces méthodologies en réalisant l’intégration entre AFM et techniques de biophotonie avec des sondes fluorescentes. Nous utilisons différents modèles expérimentaux qui ont tous comme point commun l’étude, à l’aide d’une protéine d’origine bactérienne fixées sur la pointe du levier, des propriétés élastiques des domaines membranaires qui interagissent avec ces protéines via un récepteur spécifique sur la surface cellulaire de l’hôte. Notre hypothèse de travail est que les propriétés mécaniques de la membrane dépendent de la structure de la membrane (par exemple pour faciliter l’insertion de molécules de signalisation dans des hot spots) et influencent les interactions moléculaires (par exemple en fonction du degré de compaction des lipides). Nous avons dans un premier temps validé nos méthodes basées sur l’utilisation de l’AFM (i) pour le suivi des récepteurs à la surface des cellules vivantes (Yersin et al, 2007) et (ii) pour la mesure de l’élasticité des domaines membranaires dans lesquels se situent certaines protéines de surface accessibles à l’expérimentation (Roduit et al, 2008).

 

Nous avons développé une méthode pour appréhender l’élasticité de structures intracellulaires (dans un niveau de profondeur inférieur au micron). Nous avons testé cette approche par simulation en utilisant une approche en éléments finis (Roduit et al., 2009). Pour définitivement la valider, nous avons développé la microscopie de triple corrélation AFM-super résolution photonique- électronique (CLAFEM : Correlative Atomic Force Electron Microscopy) qui permet d’établir une corrélation entre mesure de la fluorescence d’un marqueur d’organite en super résolution (30 nm environ), AFM sur cellule vivante (topogramme, mesure de force [interaction, adhésion, viscosité]) et microscopie électronique (Popoff, Janel et al., soumis). Nous avons développé un système AFM-PALM/STORM (pour les systèmes peu dynamiques) et développons un système AFM-STED (permettant plus de suivi dynamique). Ces développements se font avec le BioImaging Center Lille (www.bicel.org). Nous pensons que cette approche permettra de mieux étudier des désordres impliquant des modifications internes des membranes (en raison de trouble du métabolisme des lipides) ou des agrégats intracytoplamsiques (protéines ou organites).

 

Nous développement aussi l’AFM pour le traitement rapide des mesures de forces sur acquisition multi-échantillons.

 

Yann Ciczora, Antoine Dujardin, Vincent Dupres, Sébastien Janel, Michka Popoff

Ce travail bénéficie du soutien du CNRS par un programme PICT, de l’Université Lille 1, Programme CIFRE avec Bruker

 

-Yersin A, Hirling H, Kasas S, Roduit C, Kulangara K, Dietler G, Lafont F, Catsicas S, Steiner P. Elastic properties of the cell surface and trafficking of single AMPA receptors in living hippocampal neurons. Biophys J. 2007 Jun 15;92(12):4482-9.

-Roduit C, van der Goot FG, De Los Rios P, Yersin A, Steiner P, Dietler G, Catsicas S, Lafont F, Kasas S. Elastic membrane heterogeneity of living cells revealed by stiff nanoscale membrane domains. Biophys J. 2008 Feb 15;94(4):1521-32.

-Roduit C, Sekatski S, Dietler G, Catsicas S, Lafont F, Kasas S. Stiffness tomography by atomic force microscopy. Biophys J. 2009 Jul 22;97(2):674-7.

-Popoff, Janel et al. soumis